免疫血清的制备
一、原理www.vetedu.com"P8B7z*v:D$@$E${0K0p7W;P)e
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具有免疫原性的抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。由于抗原分子表面的不同决定簇为不同特异性的B细胞克隆所识别，因此由某一抗原刺激机体后产生的抗体，实际上为针对该抗原分子表面不同决定簇的抗体混合物(即多克隆抗体)。另外，抗体的产生具有回忆应答的规律性，牨m现为初次免疫注射与再次免疫注射后的抗体应答特点截然不同。这是由于记忆性B细胞参与再次应答所致。兽医教学参考,兽医临床交流,犬病辅助诊断系统!M0}#[0G"}.L5J#X+z
'H,e)L:_2S/S3i/T兽医人技术联盟_中国专业兽医人的技术交流平台 二、免疫方法
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.F"N7Q6]0g X%Q%A(g"I兽医教学参考,兽医临床交流 根据抗原的性质不同而异。下面以制备家兔抗人IgG免疫血清为例作具体说明。兽医教学参考,兽医临床交流6@7};y-E1O2J1\4f
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1. 用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分兔毛，以酒精及碘酒消毒皮肤；动物医学论坛8~"N"f6M1P:O2m
&g7c*L(^6g2?0S1R兽医人技术联盟_中国专业兽医人的技术交流平台 2. 第一次免疫: 用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂(FCA)乳化的抗原(人IgG)下称FCA-IgG)液1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。转自www.vetedu.com 动物医学论坛*X"n#X4w.]6X7I3A*o Q.i
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3. 第二次免疫：间隔10-14天后，于两侧 窝及鼠蹊部肿大的淋巴结内注入FCA-IgG，每个淋巴结注0.1ml，其余注入淋巴结附近皮下共1ml。如淋巴结未肿大或肿大不明显时，直接注入两侧 窝及鼠蹊部皮下。兽医教学参考,兽医临床交流-y7Z#k,w4v4p,j9D"x9B0i+@
2F K(S5Q4O&F#V2A转自www.vetedu.com 动物医学论坛 4. 间隔7-10天后，从耳静脉采血0.5～1.0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价(即试血)。效价至少应达到1∶16以上时才能放血。
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6W8E#X&z6Bwww.vetedu.com 5. 若效价未达到要求，可用不加佐剂的抗原液(人IgG)耳静脉内注射免疫。即于1周内注射3次，分别为0.1、0.3、0.5ml。间隔1周再试血。如效价达到要求应立即放血。另外,也可在第2次免疫后，以弗氏不完全佐剂(FIA)乳化的抗原(人IgG)(简称FIA-IgG)再免疫1-2次。注射部位、剂量和间隔均同第2次，再试血测抗体效价，如效价达到要求立即放血。
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:a8r*O'H4x4?0w8g,M;?兽医人技术联盟_中国专业兽医人的技术交流平台 三、放血
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,r e,s;I4o/B&b%~#U3T转自www.vetedu.com 动物医学论坛 (一) 心脏采用血法
)X3\6v6g3O/o'@5r兽医教学参考,兽医临床交流,犬病辅助诊断系统
:\*a(k:N'u(P兽医人技术联盟_中国专业兽医人的技术交流平台 1. 家兔仰面，四肢缚于动物固定架上(或由助手抓住四肢固定)；
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(K4p9d)D8Z-z'L兽医教学参考,兽医临床交流 2. 剪去左胸部兔毛，消毒皮肤；兽医教学参考,兽医临床交流7m&h$S-m!P8r.r J'@*G
(G"v9n S1h4T%[-G动物医学论坛 3. 用左姆指摸到胸骨剑突处，食指及中指放在右胸处轻轻向左推心脏，并使心脏固定于左胸侧位置。然后，以左拇指触摸心脏搏动最强的部位；动物医学论坛'W3c1c&P(q8^&u6^ |
5D:b!Z6@*|7j0?:X"[兽医教学参考,兽医临床交流,犬病辅助诊断系统 4. 用50ml注射器(连接16号针头)，倾针45°角度，对准心搏最强处刺入心脏抽血致死；
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#P1s,x!l0E1N兽医人技术联盟_中国专业兽医人的技术交流平台 5. 将抽取的血液立即注入无菌三角烧瓶中，待凝固后分离血清。兽医人技术联盟_中国专业兽医人的技术交流平台)`0~$d2A,`*];^
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(二) 颈动脉放血法动物医学论坛5L4A'a(j5f*V7t
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1. 家兔仰卧同上固定。头部略放低以暴露颈部。剃毛及消毒皮肤；兽医人技术联盟_中国专业兽医人的技术交流平台"b'E8F.g(C2q9c1c
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2. 沿颈部中线切开皮肤约10cm，分离皮下组织，直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌；转自www.vetedu.com 动物医学论坛$y%I#w"t Z4^
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3. 分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉后使之游离；
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,k8R#q-\-]"U9G*S兽医教学参考,兽医临床交流,犬病辅助诊断系统 4. 于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心端的动脉用血管夹夹住；www.vetedu.com,b/w2I+H7c!L2j&h:Y!j
2d)t/I,W-e ]8\-X,p兽医人技术联盟_中国专业兽医人的技术交流平台 5. 用尖头小剪刀在两根丝线间的动脉璧上剪一小口，插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱；
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6. 松开血管夹，使血液流入灭菌三角烧瓶中。一般一只家兔可放血80～100ml。兽医教学参考,兽医临床交流,犬病辅助诊断系统3P1v,x3N&}(~:n4M$L
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四、分离血清兽医教学参考,兽医临床交流'E2[ x-q9f$D
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将三角烧瓶的血置37℃温箱1小时，再置4℃冰箱内3～4小时。待血液凝固血块收缩后，用毛细滴管吸取血清。于3000rpm离心15分钟，取上清加入防腐剂(0.01％硫柳汞或0.02％叠氮钠，最终浓度)，分装后置4℃冰箱中保存备用。动物医学论坛 W"o4z)c5f9z/@
2Z1w'h*z&c+Q5L;^2D$_'k兽医教学参考,兽医临床交流 五、结果鉴定www.vetedu.com2E,p0r7B!x.q0s'd z:h
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以双相琼脂扩散试验测定所获免疫血清的抗体效价，并用琼指免疫电泳鉴定免疫血清中抗体的质量，应产生单一的沉淀弧线。鉴定方法的具体步骤参见有关部分。
/t e,d:I v0M兽医教学参考,兽医临床交流兽医教学参考,兽医临床交流,犬病辅助诊断系统7A8y:a'h0k;u&z2@:C
六、材料
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(一) 动物：健康成年家兔，雄性，体重2～3公斤。兽医教学参考,兽医临床交流,犬病辅助诊断系统.|%V.u$U)I/F5X
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(二) 器材：剪刀、镊子、注射器(2ml、50ml)附针头(9号、6号)、称量瓶(10ml)、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶(200ml)、手术器械一套、血管夹、黑丝线、塑料放血管等。动物医学论坛*e0g2d;q9c-p1J
0|4n*J+o.A9p'}5u兽医教学参考,兽医临床交流,犬病辅助诊断系统 (三) 试剂兽医教学参考,兽医临床交流,犬病辅助诊断系统"Y6i:B8Q)B0c"M"?,I9f
兽医教学参考,兽医临床交流6}!O7j9g.R,i0{
1. 灭菌生理盐水；
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2. 纯化人IgG(10mg／ml)；
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3. 消毒酒精及碘酒；兽医教学参考,兽医临床交流5f7O.q7i!U*M,X8q
兽医教学参考,兽医临床交流)N k1E(Y3@2m#V9f8w
4. 羊毛脂；
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(Q7d'`+}.m'I)L.fwww.vetedu.com 5. 石蜡油；兽医人技术联盟_中国专业兽医人的技术交流平台2_1~&H z6U0w&W&K
+u+]0C,}7?:x兽医教学参考,兽医临床交流 6. 活卡价苗(BCG)(75mg／ml)；
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0v4e9}7g r2p*{$d'z兽医教学参考,兽医临床交流,犬病辅助诊断系统 7. 弗氏不完全佐剂(FIA)制备：称羊毛脂10克，逐滴加入优质石蜡油40ml，边滴边研磨，分装于疫苗瓶中(每瓶10ml)，高压灭菌(8磅20分钟)后保存备用。兽医教学参考,兽医临床交流1W4m;C9m*\*O*U:O
兽医教学参考,兽医临床交流,犬病辅助诊断系统2t2~)q;^%L4A.e&`&v)|/M1`
8. 弗氏完全佐剂乳化抗原(FCA-IgG)的制备：将FIA予温(60℃30分钟)，吸取3ml于研钵中，逐滴加入活BCG(75mg／ml)0.5ml及纯化人IgG2.5ml(2.4mg／ml)牨_滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。
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