犬附红细胞体病
附红细胞体病由专性血液寄生生物附红细胞体引起，国内外亦有人称之为黄疸性疾病、类边虫病、赤兽体病和红皮病等。犬附红细胞体病(E. perekropovi）最早于1991年7月—l0月我国上海地区首次发生，患犬常呈隐性感染，感染率高，在应激条件下出现急性临床症状，可伴发呕吐、腹泻、便血、脱水等急性出血性胃肠炎症症状[1]。兽医教学参考,兽医临床交流#K8i1L2A7s*V
1. 病原学
4z5r.[/I7F:a!E兽医教学参考,兽医临床交流,犬病辅助诊断系统1.1 分类 兽医教学参考,兽医临床交流,犬病辅助诊断系统"N(F0X9b,n0w5a
附红细胞体既有原虫特点，又有立克次体的特征，长期以来其分类地位尚未完全确定，目前普遍采用1984年第八版《伯杰氏细菌鉴定手册》为分类依据，将附红体划分为立克次氏体目（Rickettsiares），无形体科（Anaplasmataceae），血虫体属，亦称为附红细胞体属。而近年来，随着对附红细胞体的深入研究，1997年Neimark H等[2]采用DNA测序、PCR扩增和16S rRNA序列分析发现它们的生物进化树的基因序列与柔膜体科的支原体属较为接近，其同源性可达到80%-90%，这种广泛寄生于脊椎动物的无细胞壁生物在支原体属的肺炎型组内形成一个新的分支，因此命名球形支原体（Mycoplasma coccoides comb nov，MCCN）。最近Messick[3.4]用同样的方法，在犬血液中发现的附红细胞体样寄生物分别命名犬嗜血霉形体(Mycoplasma haemocanis comb nov，MHCN)。但Uilenberg U等人通过研究发现附红细胞体与支原体属16S rRNA基因序列的同源性并不是很高，因此列入同一种属的依据不充分[5]。由于附红细胞体属类的病原微生物主要寄生在红细胞表面并借助吸血昆虫，而支原体属的绝大多数病原体以非红细胞为主要寄生对象且不需要这些特殊的媒介就可以在哺乳动物及人之间传播。因此很多学者建议应测定整个附红细胞体基因组序列，结合其他生物学特性确定其种属分类地位。
%b)B0r'x3[&z&i)Q)X0L兽医人技术联盟_中国专业兽医人的技术交流平台1.2 形态特点 兽医教学参考,兽医临床交流,犬病辅助诊断系统&t+?,h0v4X-o
附红细胞体是一种典型的原核生物，无明显的细胞器和细胞核，是多形态生物体，不同的畜种存在着一定的差异。犬附红细胞体鲜血涂片光学显微镜下观察，多为环球形、圆形、短杆形，少数呈顿号形和杆状。电镜下观察，显示多种形态，无细胞壁，由单层限制膜包裹着，胞膜下可见直径为10纳米的微管[6]，在胞液的外围和中央的稀薄区常见类核糖体样电子致密颗粒聚集，其中电子密度大的类核糖体颗粒无规则的分布在胞浆内，偶尔形成串索。附红细胞体直径通常为0.2～0.8μm，最大可达2.6μm。病原寄生于红细胞表面的凹陷中，但不侵入红细胞内，与红细胞膜之间有25～30nm的间隙，并通过其表面的纤突与红细胞膜接触，这些纤突一旦附着在红细胞表面，则使红细胞膜产生一些小而深的凹陷和变形，改变细胞膜的结构和通透性，使附着的红细胞局部呈锯齿状、菠萝状、星芒状等，个别可见细胞膜表面形成洞。当单个或多个散在的或多个聚成小团状的附着在红细胞表面上时，使红细胞表面有突起，导致红细胞的变形破裂。动物医学论坛;]!P+T k7s2I7h6B:\0]
1.3 运动性与折光性
.O.D(M3k;c+k!W转自www.vetedu.com 动物医学论坛血悬滴标本中，单个附红细胞体呈游离态，常作摆动，翻滚，上升，下降等运动，有很强的运动性；附红体聚成团状者其活动能力减弱，仅呈现滚动或摆动；当接近红细胞时附红体活动力明显减弱，一旦附着于红细胞附红细胞体，立即停止运动，整个红细胞连同寄生的附红体成为一体，有轻微的摆动、扭动现象。滴加等量的5OmL／L醋酸或10mL／L盐酸时，红细胞破裂，附红细胞体的活动性加强，运动范围加大；滴加1g／L碘溶液后，运动停止，此时，即使用PBS或生理盐水洗涤，其活力也不能恢复[7]。www.vetedu.com6L0O$r2o+Q"^0p
在显微镜下轻轻旋动显微镜微调，可见附红体折光性很强，象一轮轮淡蓝色的宝石（红细胞），镶着一颗颗闪闪发光的珍珠（附红体）一样。兽医教学参考,兽医临床交流,犬病辅助诊断系统"e-|3F:E!@*a/x6W
1.4 生物学特性兽医人技术联盟_中国专业兽医人的技术交流平台8e9[&X:I!W/G-t
1.4.1 体内增殖与分布兽医教学参考,兽医临床交流(T:Y)T5{6`4O
附红细胞体在宿主体内红细胞上以出芽法增殖。感染后，可在动物血液，组织液，脊髓液中游离[8]，其中动物骨髓中浓度最大，其次是全身末梢血，而动静脉血中的附红体含量相对少，说明动物感染附红体后，骨髓是最好的繁殖场所，而后释放到血液中。末梢血中虫含量多于循环血，可能是末梢血流动缓慢而循环血流动相对快，与机械性的作用有关[9]。转自www.vetedu.com 动物医学论坛'B8O7m:P*G+U!L6~
1.4.2 培养及染色特性 www.vetedu.com n2e&x4B,Y!R:S,B2o*q
附红细是以红细胞为作为生长的载体，属于细胞依赖性体外培养，因此真正纯化的非细胞依赖性的附红细胞体培养以及体外分离较为困难[10]。1996年Nonaka N [11]等人通过实验观察发现感染附红细胞体的红细胞对葡萄糖的消耗量增加，观察到附红细胞体在生长过程中要消耗葡萄糖，并指出附红细胞体可能是通过糖酵解的方式代谢葡萄糖最终生成乳酸。华修国等人（1997）用血液普通肉汤、营养琼脂、沙堡弱琼脂培养基分离培养犬附红细胞体结果均为阴性。目前，国内外关于附红细胞体在体外培养的报道不断出现，打破了附红细胞体只能在活细胞内生长繁殖的说法。2002年张守法等用BPMI-1640，M-199，D-MEM3种培养液
9w5W!F$v$}兽医教学参考,兽医临床交流作为基础培养基，再分别按体积分数加入40%的犊牛血清，采用普通恒温培养箱(37℃)进行牛EH的体外培养获得成功其中在RPMI-1640培养基中，每12h更换1次培养液，并补充适量正常红细胞，获得了99%的感染率，连续传代可达44代以上，填补了国内此项研究的空白[12]。
-K#o4]6h8_&U%e7{,q"W9m(c兽医人技术联盟_中国专业兽医人的技术交流平台附红体苯胺染色易着色，为革兰氏染色阴性，姬姆萨染色呈紫红色，瑞氏染色为蓝紫色。吖啶橙染色在荧光显微镜下可见各种形状的附红细胞体单体，呈橘黄色。在急性病例中，病原为淡黄色至浅绿色的小点状，不易辨认，通常位于红细胞上或红细胞边缘，位于红细胞边缘变性的附红细胞体更小，通常为绿色点状。兽医人技术联盟_中国专业兽医人的技术交流平台#k2I1_3h:|3s4|-n
2. 流行特点 兽医教学参考,兽医临床交流6e#F1K;m+}:F
附红体病是人畜共患的疾病，主要寄生于脊椎动物红细胞表面。截至目前附红细胞体在世界范围内30多个国家均有报道发现感染，感染率的高低与不同地区的气候差异，血吸虫的分布，检测方法有很大关系。附红细胞体宿主特异性强，猪、牛、羊、犬、兔、鸡和人等都是附红细胞体易感动物，其中以猪感染附红细胞体后发病最为严重，犬附红细胞体通常病毒力较弱、致病力不强，呈隐性经过。
8}#{%}6t7y兽医教学参考,兽医临床交流,犬病辅助诊断系统该病多发于夏秋时高热、多雨且蚊虫繁殖滋生季节，且南方发病率高于北方。犬附红细胞体传播途径可以以接触、昆虫媒介、血源传播等3种方式 。①接触传播：是指患犬与健康犬之间、患有附红细胞体感染的人群与健康犬之间通过直接接触而发生的传播；②昆虫媒介传播：是指经吸血昆虫如，虱子、蚊子、蛰蝇等的携带与叮咬而发生的传播，这种传播方式是本病的重要途径；③血源传播：是指用了被附红体污染的注射器、针头等医疗器械，或通过互相舔咬破损的伤口传播。其它传播途径，如垂直传播，畜禽中现已在猪、奶牛发现可垂直传播，而鸡的附红细胞体感染不能经卵垂直传播，犬附红细胞体是否可经过垂直传播目前尚无报导。
8a'G6`9q8C'r4v7C兽医教学参考,兽医临床交流,犬病辅助诊断系统3. 发病机制 兽医教学参考,兽医临床交流,犬病辅助诊断系统"I'p"I&O5n$D
附红细胞体的致病机理尚未完全揭示。犬感染附红体后多呈潜伏状态，不一定表现出临床症状、体征。附红体与红细胞有一定亲和性主要由于红细胞本身的静电引力或受体一配体的粘附性使附红体能吸附于红细胞上，并从中吸取养分，使红细胞膜出现损伤，甚至出现空洞。魏梅雄等人[13]在试验中发现，红细胞呈空斑样、空泡样或齿轮样病变。由于红细胞被附红体寄生后，其细胞膜通透性增加和膜脆性增高，还有的出现膜凹陷和空洞，使血浆进入红细胞内引起红细胞破裂。当机体免疫力下降或受到其他病原体侵袭时，附红细胞体大量增殖，变形的红细胞增多而不能及时通过脾脏、淋巴结即使被清除，逐渐出现贫血及黄疸。当免疫识别细胞进行自身识别时，将附红体寄生的红细胞误认为是异种抗原，一方面加速机体内各类吞噬细胞(脾、淋巴结、肝、骨髓、脑、血液中以及肠系膜上的固定和游离的大、小吞噬细胞)吞噬这些负荷附红体的红细胞，从而加剧了贫血和血红蛋白尿的形成，另一方面导致机体产生自家抗体招致II型过敏反应，产生自身抗体IgM型冷凝素并攻击被感染的红细胞，进一步引起自身免疫溶血性红细胞溶解，加重了贫血和血红蛋白下降。此外，由于附红体大量繁殖，使代谢紊乱、血糖分解上升，引起低血糖。当病犬血清碱性磷酸酶、肌酸激酶和谷草转氨酶活性升高，提示附红细胞体的感染已引起了广泛的组织器官损伤[14.15]。最终病犬生理生化值的改变以及部分组织器官严重损伤，导致机体代谢紊乱、酸碱失衡等严重后果，患犬死亡。www.vetedu.com6J:s/e&D-E.@8D
4. 临床表现及病理变化
6M:I4G#N(l#I兽医教学参考,兽医临床交流,犬病辅助诊断系统本病以贫血、黄疸、发热为基本特征。人和动物多呈隐性经过是附红细胞体常被人们忽视的重要原因，当外界应激因素和病原体侵入等因造成机体抵抗力下降时，患犬表现精神沉郁，食欲不振，被毛粗乱，明显消瘦，眼结膜发红并可出现小出血点，体温升高至40℃左右。感染严重的患犬由于贫血造成机体体质虚弱，食欲废绝，强制运动时可导致心率、呼吸加快，尿少而色深黄。临床检查可视粘膜黄染，体温升高至41℃左右，大多数感染严重的患犬伴有呕吐、腹泻等急性胃肠炎症状，呈现不同程度的脱水和渐进性消瘦。此外，母犬感染本病时多有空怀、流产、弱胎、死胎等繁殖机能障碍。兽医教学参考,兽医临床交流,U$e,x!S/[)@-g-w
自然感染犬脑、心、肺、肝、脾、肾、肠道等均表现溶血性病变，脑组织充血、水肿，心肌变性坏死，肝、脾组织中吞噬细胞含铁血黄素沉着等病理组织学变化。表明溶血是附红体病的病理特征。华修国复制脾切除犬的附红体病，其病理组织学变化与自然感染相似。肝、肠绒毛上皮和腺上皮、肾小管等组织的细胞出现浑浊肿胀和水泡变性，病变以肝脏最严重，还有心肌和横纹肌肌纤维断裂及颗粒变性、肺泡扩张等。
:V2b/T,~;~ k'\5c兽医人技术联盟_中国专业兽医人的技术交流平台有学者将附红体感染强度分为轻、中、重度三级，平均100个红细胞中有30个以下被附红体寄生者为轻度，30～60个者为中度，60个以上者为重度[12]。也有学者将被检红细胞1％～29％被感染时作为I级(轻度)， 30％～50％为Ⅱ级(中度)，大于50％为Ⅲ级(重度) 。动物医学论坛9q7E+j.W#m0C6?,C8t.Y
5. 实验室检查兽医教学参考,兽医临床交流'r6~;[:T.[5~2Z9a
5.1 血压片检查 兽医人技术联盟_中国专业兽医人的技术交流平台-C9g2H/x'W)q$['K"q0~
采患犬血液加入等量生理盐水稀释，取其一滴压片后用油镜1000倍暗视野镜下观察，可见到游离在血液中的附红细胞体呈环状、球状、短杆状、半月状等多形态的折光小体在血浆中呈现摆动、伸曲、翻滚等运动，另外可观察到一个到多个被附红小体吸附到红细胞上表面，以及少数变形的红细胞。该方法简单易行，操作简便，但经某些学者临床观察发现，血压片方法有时在感染发病后血压片中无法找到病原体[16]，因此在诊断过程中，易产生假隐性结果。www.vetedu.com1U:m&i1D,{-o)K-d"j5x
5.2 血涂片检查
"J*[#R;s$E5A/S9l$K*Z兽医教学参考,兽医临床交流,犬病辅助诊断系统取患犬耳静脉血滴于载玻片上，制成血液涂片，用瑞-姬姆萨染色后在1000倍的油镜下可观察到许多圆形、椭圆形、短杆状蓝色小体附着在红细胞上，特别严重时可见红细胞变成空泡状。另据郑丽艳[17]等报道，采用吖啶橙染色，荧光显微镜下观察在红细胞边缘出现淡绿色荧光，小体者为阳性，这种方法检出率较高，非常有效，值得推广。兽医人技术联盟_中国专业兽医人的技术交流平台.\0t+w0V'H Z-G+l+k
5.3 血清学检查
n/m.M"M:Y6J#d"V&i%n兽医教学参考,兽医临床交流目前普遍采用补体结合试验(CFT)、间接血凝试验(IHA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、 免疫荧光试验等特异性检验方法，其诊断结果确实并可作流行病学调查。补体结合试验主要CFT主要用于羊附红细胞体病的诊断和检测，1955年Splitte L首先采用CFT诊断猪附红细胞体病，该方法对急性病例诊断效果好，但慢性带菌者出现阴性反应，因此不适用于犬附红细胞体诊断。间接血凝试验，滴度大于1：40为阳性，此法灵敏性高，能检出补反阴转后的耐过病畜，但从血浆中分离某些可溶性患犬附红细胞体抗原的过程复杂，需使用超滤细胞及分子筛色谱；酶联免疫吸附试验的敏感性很高，但同样不适用于急性期诊断；ELISA方法目前主要用于绵羊附红细胞体病和猪附红细胞体病的诊断。韩惠瑛等建立了辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白的酶联免疫吸附试验(PPA一ELISA)检测方法，用这种方法检测猪血液中的附红细胞体，具有很高的敏感性和特异性，重复性良好，适合于对附红细胞体病原的检测。
(Y,J,e8N'v%D动物医学论坛5.4 分子生物学技术
.c1`!S*B"h'm1o$P#U动物医学论坛近来国内外已建立的DNA探针法、PCR法和定量PCR检测来诊断附红体病。转自www.vetedu.com 动物医学论坛&c.c0V/A&b%I,S I&v!p
5.4.1 DNA探针法
4|/U:A4^8h(b'h(h5f动物医学论坛Obers R D等[18](1990)通过建立猪附红细胞体的DNA文库，筛选阳性克隆并设计探针。经过多次实验证明所设计的探针能与猪附红细胞体感染血样DNA杂交，而与马附红体阳性血样DNA、感染埃里希氏(Ehrlichiacanis)犬血液DNA等对照组不发生交叉反应，特异性非常好，但同时发现该探针只能与感染猪附红细胞体后第7天的血液DNA杂交，而此时感染猪已表现出明显的临床症状，通过血片染色检查也可以看到大量的病原体。因此，此方法不宜用于疾病潜伏期附红细胞体感染的检测。转自www.vetedu.com 动物医学论坛-a;x5[+n)u8n&d/?+{
5.4.2 PCR测定法
,K0M%d2y%y8Xwww.vetedu.comPCR方法对附红细胞体的检测具有极高的敏感性，既可用于急性附红细胞体病的检测，也可用于临床健康带菌患犬的检测。1993年，Gwaltney S M等[19] 首次根据猪附红细胞体DNA文库中KSU-2克隆的序列设计引物建立了猪附红细胞体的PCR诊断方法,以纯的猪附红细胞体和感染猪的附红细胞体的血样DNA提取物为模板，扩增出429bp的片段，敏感性试验表明，该技术对猪附红细胞体基因组含量的最低检测限为450pg，对脾切除猪在人工感染后第24h即可检测出。1994年，他们对Oberst R D等的PCR方法进行了适当的改良，并比较了PCR方法和IHA对猪试验性感染猪附红细胞体后血液样品的检测结果，发现PCR技术不但能检测出4头猪附红细胞体感染猪的所有血样，而且对其中2头猪感染前的血样检测结果也为阳性，但IHA只能检测出其中1头抗体阳性猪，证实猪感染猪附红细胞体后抗体应答很弱，也证实了PCR方法确实优于IHA[20]。兽医教学参考,兽医临床交流,g;y.?2o"r
目前许多国内外学者根据16S rRNA基因序列设计引物，已经建立了多种动物附红细胞体种感染的PCR检测方法，经多次实验效果证明这种方法效果特异、准确、敏感。车京波等人[21]根据Genbank K中已经发表的犬附红细胞体基因序列设计合成一对特异性引物，通过PCR检测法可以扩增出一条与目的片段大小一致约630bp的基因片段。该方法仅能从犬附红细胞体扩增出目的基因片断，经实验明PCR检测法检出率较染色镜检约高出约10%左右，避免了染色镜检在实验操作过程中所带来的假阳性或假隐性误差，提高了检测结果的准确性。Mcauliffe L等人建16S rRNA PCR检测法结合变性梯度凝胶电泳法检测附红细胞体，其原理基于为防止化学变性剂使DNA链间的分离而造成片段飘移[15]。且变性梯度凝胶电泳法可快速、特异检出在附红细胞体感染时是否还伴发其他继发性感染，同时也为其它血源性病原体的检测开辟了一条崭新的道路。
.z)})u:Y&`3P兽医教学参考,兽医临床交流5.5.3 定量PCR测定法
8q+},@-Q;[4c(`+s兽医教学参考,兽医临床交流,犬病辅助诊断系统1999年，Cooper P等首次建立了猫巴尔通氏体的竞争定量PCR检测方法。Tasker S等(2003)将实时定量PCR(Real time PCR)方法用于检测猫的两种血巴尔通氏体，结果显示该方法可以准确的反应血液中的病原量和血液生理指标的变化，尤其适用于评价药物的治疗效果。Willi B等建立了检测分离自一只患有严重溶血性贫血的猫血样中的一种新颖独特的猫巴尔通体的特异性实时定量PCR技术。16S rRNA基因序列和亲源关系分析显示，它与啮齿类动物的血营养霉形体属的物种球形附红细胞体和鼠巴尔通体更接近[22]。兽医教学参考,兽医临床交流,犬病辅助诊断系统5c+g(U+\%B(x7J6{
6. 治疗
3z$I!s*n#u |!J-R转自www.vetedu.com 动物医学论坛犬患感染附红细胞体治疗可采用咪唑苯脲、青蒿素、大蒜素、四环素类、贝尼尔药物等。华修国[23]等人经研究发现青蒿素、大蒜素能有效抑制、杀灭附红细胞体，对治疗附红细胞体病疗效显著，优于四环素和新胂凡纳明。在运用上述药物同时，还需对患犬注意进行适当的补充维生素以及造血物质，施行必要的强心、补液、纠正酸碱平衡措施。该病有复发的可能，待临床症状消失，附红细胞体镜检阴性后，方可停止治疗。此外附红细胞体病在治疗过程中应注意尽量减少地塞米松的应用，经有关学者研究发现高剂量的地塞米松使用，使宿主体内淋巴细胞以及单核细胞增值产生免疫抑制，从而导致提高患病动物的易感率，为本病的治疗带来困难[24]。
;Q+_"L5f-H1q+O动物医学论坛www.vetedu.com.b2e2c'J.f(c.@(y9N,N
[ 本帖最后由 fjnplzj 于 2007-11-8 16:24 编辑 ]
|
